ImageJ处理免疫荧光数据进行双阳性信号共定位分析

对于细胞生物学和分子生物学研究的小伙伴来说，免疫荧光是观察蛋白定位和表达的重要手段。当实验涉及两个蛋白是否在同一细胞区域共定位时，仅靠肉眼观察往往不够客观，因此需要进行双阳性信号共定位分析。在双通道免疫荧光实验中，通常会有两个不同的荧光信号，如：绿色通道（Green）：蛋白 A和红色通道（Red）：蛋白 B；当两个蛋白在同一空间位置出现时，叠加后通常会呈现黄色信号，这就是我们常说的共定位。

共定位分析主要用于：判断两个蛋白是否共定位、定量共定位程度和比较不同处理组之间的共定位差异。但需要注意的是其不能作为两个蛋白质的直接证据。

本期教程我们来学习一下如何使用ImageJ处理免疫荧光数据进行双阳性信号共定位分析。

1.打开ImageJ软件，点击File—Open—选择要处理的免疫荧光的图片；

2. 对图片进行颜色通道拆分操作，依次点击Image—Color—Channels Tool—Color，在跳出的对话框，点击OK；

3.设定标尺，点击线性工具，复制比例标尺，依次点击Analyze—Set Scale，在跳出的对话框，根据实际标尺修改Known distance和Unit of length；

4. 点击“线选”工具，在红色通道图形中，选择一个形态较单一、结构完整的细胞，沿细胞关键区域（如蛋白可能分布的区域）绘制线段，依次点击 Analyze—Plot Profile，软件出现Red通道的荧光强度分布曲线信息，点击live，点击date—save date，对数据进行保存，这里保存为“red.csv”；

5. 采集另一通道数据，拖动示例图下方的进度条切换到绿色荧光通道，此时Plot信息会随通道切换自动更新，重复4的操作，将绿色通道数据命名为“green.csv”保存。

6.Graphpad绘图，打开Graphpad软件，以中文版为例，在XY处，Y处选择为每个点输入一个Y值进行绘图；

7.复制数据到Graphpad中，然后点击图表中的，数据1，并选择折线图；

8.对折线图进行细节美化，其中包括颜色、线条大小、字体、标题、坐标轴等进行细节美化；其最终效果图如下图所示：

在免疫荧光实验中，双阳性信号共定位分析是揭示蛋白空间关系的重要手段。借助 ImageJ，我们可以从简单的荧光图像中提取出客观、可量化的共定位指标，从而更加科学地评估蛋白之间的共定位关系。大家都快去试试吧！

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