大家新年好，马年大吉，我是阿瓜，大家多久返校？新的一年祝大家实验顺利、数据良好、文章多多、顺利毕业和找到理想工作！前面我们讲了免疫组化如何通过Image J软件进行分析免疫荧光强度，接着我们通过用Image J分析计算视野内细胞数量。

1.打开Image J软件，点击File—Open—选择要处理的免疫荧光的图片；

2.对需要处理的图片进行颜色通道拆分：点击Image→Color→Split channels；分离出的通道主要有三种，分别为red，green和blue；

3.选中要分析的通道图片，这里以blue通道为准，因为计算细胞总数一般是计算细胞核通道，所以选择blue通道；点击Image—Type—选择8-bit；

4.选择目标通道，这里以Blue通道为例，调整阈值，点击Image—Adjust—Threshold；统一调整阈值，这里设置为30，这样可以减少带误差。使用红色（Red）来标记选中的区域，勾选“Dark Background”以适应黑色背景的荧光图像。这里需要注意的是，红色标记即表示区域已选中，点击Apply；

5.打断细胞重叠部分，依次点击Process→Binary→Watershed;

细胞打断后的结果如下图所示：

6.为排除染色及成像过程中产生的杂质对细胞大小测定的干扰，在进行批量分析前需设定面积筛选阈值。依次点击 Analyze→Tools→ROI Manager 功能，依据本项目细胞的形态学特征，手动圈选视野中具有代表性的、相对较小的目标细胞。将其测得的细胞面积设定为最小判定阈值，以确保后续分析的准确性。

点击用圆形工具圈定较小的细胞，点击Add→Measure，测定细胞面积;

7.自动计数，依次点击Analyze→Analyze Particles；（因为用画圈工具进行ROI圈定细胞，可能存在面积偏大的情况，所以在设定的size可以比我们ROI圈定的细胞面积稍小一点；如这里设定20；）

计算出来的结果如下图所示，其中Count为细胞数量，但是要注意这个数量计算是相对的，不是完全精准的。

接着对其他的组别进行计算，然后进行使用Graphpad进行绘图；如下图所示：

ImageJ通过调整阈值、设置细胞大小范围、选择圆度参数以及应用Watershed算法分割粘连细胞，用户可以针对不同染色效果、不同细胞类型的图像进行精细化参数调优，显著提高计数的准确性。以上就是ImageJ计算细胞数量的基本步骤，大家根据以上步骤即可计算出细胞个数。大家快去试试吧！

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