一、链特异性（Strand-specificity）简介

链特异性测序（Strand-specific RNA-Seq）是RNA测序（RNA-Seq）的一种改进方法，记录每条测得的序列来自RNA的正义链（sense strand）还是反义链（antisense strand）。

在传统的RNA-Seq中，链的信息通常丢失，而链特异性测序可以帮助更准确地了解基因表达，特别是在下列情况下：

• 基因重叠区：部分基因在不同链上互为反义转录，链特异性测序可以识别这些转录本的来源。

• 反义RNA的表达：这类非编码RNA在转录调控中起重要作用，传统测序很难区分它们与正义链上的转录本。

• 基因簇的解析：密集区域的转录分析会更精准，因为我们知道转录来自哪个链。

二、链特异性测序的原理

链特异性测序的原理主要基于RNA样本制备和文库构建中的化学修饰或酶学反应，保证在反转录（RT）、接头连接或PCR扩增时仅针对某一链进行选择性扩增。常用的链特异性技术包括：

1. dUTP法（dUTP Incorporation Method）

   • 在RNA逆转录过程中，使用含dUTP的随机引物代替部分dTTP。

   • 第二链的合成后会被特异性降解或不扩增（如通过UNG酶处理），从而只保留第一链的信息。

2. Ribo-Zero/Poly(A)法结合链特异性

   • 通过去除核糖体RNA（rRNA）或富集poly(A)+ RNA，并结合化学标记实现链特异性。

3. SMART-seq方法

   • 一种全转录组测序法，可以检测极低丰度RNA，同时保留链信息。

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三、链特异性数据的分析流程

链特异性测序的下游分析比普通RNA-Seq复杂一些，需要考虑链信息来提高分析精度。以下是详细的分析流程：

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1. 原始数据处理和质量控制

• 使用FastQC检查原始数据质量，如测序错误率、GC含量分布和接头污染。

• 如果检测到接头序列，使用Trim Galore或Cutadapt进行去接头和低质量片段的去除。

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2. 比对到参考基因组

• 工具：HISAT2、STAR或TopHat2。

• 注意：

  • FR：正义链cDNA在第一条read（R1）中，反义链cDNA在第二条read（R2）中。

  • RF：与FR相反。

  • 在比对时要明确声明链特异性信息，例如HISAT2中的参数--rna-strandness。

  • 常见的链特异性参数有：

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3. 转录本组装与定量

• 使用StringTie或Cufflinks对转录本进行组装。

• 工具如featureCounts或HTSeq-count也支持链特异性计数，需要使用-s参数指定链特异性：

  • -s 1：正义链测序。

  • -s 2：反义链测序。

  • -s 0：不区分链。

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4. 差异表达分析

• 使用工具：DESeq2、edgeR或limma-voom。

• 输入：特征计数矩阵（基因 × 样本）。

• 注意：差异表达分析可以考虑链特异性，以检测反义RNA或重叠基因的表达变化。

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5. 功能富集分析

• 使用clusterProfiler或GSEA进行基因本体（GO）分析和通路富集（KEGG/Reactome）。

• 检测反义RNA、lncRNA等的功能可能需要更多的注释数据库支持。

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6. 可视化分析

• IGV（Integrative Genomics Viewer）：用于查看比对结果，检查感兴趣基因在不同链上的表达模式。

• heatmap.2（R包gplots）或ComplexHeatmap：绘制表达谱热图，观察样本间的表达趋势。

• ggplot2：用于火山图、PCA等可视化分析。

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四、链特异性数据分析中的注意事项

1. 反义转录本与背景噪音区分：低丰度转录本容易被测序噪音掩盖，需要仔细比对和多次验证。

2. 比对参数的优化：比对时忽略链信息可能导致假阳性结果。

3. 文库构建偏好性校正：不同链特异性策略可能有偏向性，需要在分析时校正。

4. 非编码RNA分析：链特异性测序特别适合分析lncRNA、circRNA等非编码RNA。

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五、总结

链特异性测序是解析复杂转录组的一项重要技术，尤其在基因重叠、反义RNA和基因簇分析中具有显著优势。链信息的保留和合理使用，可以提高比对和差异表达分析的准确性，同时为生物学发现提供更深入的视角。

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